什么是圆二色光谱术（Circular Dichroism Spectroscopy）？

圆形二色性光谱学
圆二色光谱（CD）是一种重要的分析技术，用于通过分子的光学活动来分析其手性。

目录

圆二色光谱法简介
圆二色光谱的仪器设备
使用圆二色谱仪研究蛋白质的折叠、形态和功能
圆二色光谱的实验

圆二色性光谱简介
圆二色谱（CD）是一种重要的分析技术，用于通过分子的光学活动分析其手性。CD可以应用于各种各样的分子结构，但在科学界发现了对大分子结构的阐释，特别是蛋白质和核酸的青睐。

圆二色光谱学利用了 "棉花效应 "所描述的基本特性。请看这里的维基百科文章。圆偏振光可能优先被一个光学活性分子吸收，在发色团的粘性。

圆偏振光谱是一种技术，测量光学活性物质中左右圆偏振光的吸收差异。CD信号在光学活性（手性）物质中被观察到；然而，手性也可以通过与手性色基的共价键或当色基被放置在不对称环境中时被诱导。CD通常用于蛋白质构象、生物分子的结构分析和手性鉴别。

电磁波含有电场和磁场成分，在光束传播的方向上垂直振荡。这些成分的方向性定义了波的偏振。在非极化光或白光中，电场和磁场在许多不同的方向振荡。在线性偏振光中，电磁波沿单一平面振荡（图1，左），而在圆偏振光（CPL）中，两个电磁波平面彼此相差90°，这个平面随着光束的传播而旋转（图1，右）。

图1. 线性（左）和圆形（右）偏振光。
光学活性分子可以用它们的手性，或分子结构的不对称性来描述。手性分子表现出圆形双折射或光学旋转，在这种情况下，通过光学活性介质的光的速度将取决于介质的折射率而有所不同。因此，左手的CPL将以不同于右手的速度在手性样品中传播。当一个手性分子在不同程度上吸收左手和右手CPL时，所产生的电场矢量会描画出一个椭圆。由于线性偏振光可以被认为是左手（El）和右手（Er）圆偏振光同等强度的叠加，当圆偏振光穿过双折射材料时，CPL波之间的相位关系发生变化，线性偏振波被旋转，椭圆偏振光现在被倾斜（图2）。这个椭圆度（q）作为波长的函数，定义了圆二色性光谱。

图2. El和Er成分被同等吸收时（左），导致线性偏振光，和不同等吸收时（右），导致椭圆偏振光。
圆二色性光谱仪的仪器
光弹性调制器（PEM）
在圆二色谱分光光度计中，线性偏振光被创造出来，随后产生圆偏振光。未偏振的光首先通过一个偏振器，其中晶体轴和分子的方向是一致的。然后用一个光弹性调制器（PEM）将线性偏振光转换成圆偏振光。如图3所示，PEM是一个匹兹堡弹性元件，粘在一块引信石英上。当50千赫兹的频率被施加到pizeoelastic元件上时，它对石英块产生压力，引起双折射和两个偏振成分。当正交电场的相位偏离1/4波长时，就会发生圆极化。

图3. 用于将线性偏振光转换为圆偏振光的光弹性调制器。
氮气吹扫
氙弧灯产生大量的紫外线辐射。当这种辐射与氧分子相互作用时，会产生臭氧。臭氧会氧化仪器中的镜子表面，降低其反射率和通过单色器聚焦光线的效率，降低信噪比。此外，氧气本身在紫外线区域也被吸收。通过用氮气吹扫单色仪，不仅可以保持镜子的反射率和寿命，而且减少了氧气的吸收，使样品数据可以进一步进入远紫外。图4提供了氮气吹扫的建议

CD是一种组合技术，可以定量或凭经验提供手性发色团的分子和电子结构信息。本质上不是手性的发色团可以被放置在不对称的环境中，或者与手性发色团耦合，CD可以被诱导到这些非手性电子转换中。大多数CD实验需要很少的样品准备，容易进行，并且是无损的，所以样品可以被回收。与其他分子结构技术相比，样品测量可以在液相或固体、薄膜或凝胶中获得，浓度也很低。

使用CD光谱学研究蛋白质的折叠、形态和功能
通过圆二色性研究蛋白质的二级结构
蛋白质采用独特的构象，经过优化以执行特定的结构、调节或酶的功能。因此，关于蛋白质结构的信息对于阐明蛋白质的功能是至关重要的。远紫外线（180-250纳米）区域探测肽骨架链，其phi和psi角的旋转取决于蛋白质的构象。有两个吸收带构成了远紫外CD光谱：190纳米左右的强p à p*和210-220纳米之间较弱但较宽的n à p*转变，见图6。

图6. 肽键（上）和远紫外CD光谱中观察到的相应的紫外转换（下）。
这两个吸收带产生了不同的特征带（图7），这些特征带可以被分解以估计不同溶液和环境条件下的蛋白质二级结构成分。虽然四个二级结构成分（a-螺旋、b-片状、转折和无序）中的每一个都有区别的CD光谱，但去卷积比给每个成分分配一个带子要复杂。二级结构分析需要基于一组已知二级结构成分的参考光谱的曲线拟合程序，通过回归分析来估计未知（或样品）光谱中的成分。芳香族侧链残基和二硫键也是已知的对远紫外光谱的贡献，使估计更加复杂。二级结构分析最好用于澄清CD数据的偏移。更加相似的二级结构，如b-sheet和turn，可以被挑出来，并且可以有把握地确认从大部分的sheet到大部分的turn的结构变化。

三级结构
近紫外光CD光谱（250-320纳米）反映了蛋白质的三级结构，由芳香族氨基酸的侧链组成。三个残基，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，分别在255-270纳米、275-285纳米和290-305纳米之间表现出精细的结构峰。芳香族残基的数量和接近程度将影响CD信号的强度，以及二硫键、氢键的程度和折叠构象中发色团的刚性。

DNA结构
DNA的CD光谱提供了关于分子二级结构的信息，这取决于碱基对的堆叠方向。虽然碱基对本身没有内在的手性，并且单独不会表现出CD信号，但它们与由糖基组成的DNA骨干链共价结合。糖基的手性在碱基对的p à p *转变中诱发了CD信号，在200-300纳米处观察到。

图8. 来自牛胸腺的DNA的CD光谱。

每种DNA构象都显示出不同的CD谱。最著名的B型是由沃森和克里克发现的，是一种右手双螺旋，其碱基对垂直于螺旋。B型结构通常在290纳米处有一个正的最大值，在245纳米左右有一个负的最大值，在260-280纳米之间有一个宽的正的峰值。A型结构是更紧凑的、右手的双螺旋结构，通常观察到的是RNA，在260纳米处有一个正峰，在210纳米处有一个负峰。Z型结构是一种左手双螺旋结构，在290纳米处显示一个负带，在260纳米处显示一个正峰，负值最大约200纳米。G-四联体（G4）二级结构是独特的，因为它们折叠成富含鸟嘌呤的四条链。这些四联体可以形成平行或反平行结构，这取决于鸟嘌呤残基的堆叠相互作用。平行的G4结构在260纳米处有一个正带，而反平行的结构在260纳米处有一个负带，在290纳米处有一个正峰。

热稳定性
温度的变化可以影响生物分子结构并诱发聚集，导致各种与疾病有关的构象，以及影响生物制药在储存期间的稳定性和药效。这些研究被用来监测蛋白质的折叠/解折叠，以及溶剂、pH值和配体对生物分子热稳定性的影响。热稳定性的评估是通过监测感兴趣的峰值的单一波长与温度的关系（图9，顶部）或通过在增加温度时获取光谱扫描（图9，底部）。

图9. 在222纳米处获得的热熔化曲线（顶部）和从20°C到90°C的CD光谱扫描（底部），用于评估溶菌酶二级结构的热稳定性。
蛋白质折叠的可逆性通常被研究，以验证一个蛋白质在加热时是否能发生结构变化，并在冷却到初始温度时恢复到其原始形式。如果蛋白质的折叠在温度测量过程中是可逆的，那么热力学参数，如吉布自由能、（DG）焓（DH）和熵（DS）的变化，以及熔化温度（Tm）可以通过拟合热熔化曲线获得。

圆二色性光谱的实验
啤酒定律。样品浓度和细胞路径长度
CD是一种基于比尔定律的吸收技术

A=εlc

其中A是吸光度，e是摩尔吸收率常数，l是细胞路径长度，c是发色团浓度。因此，样品吸收的光量与浓度和路径长度有关，对获得准确的CD数据至关重要。通常，当吸收最大波长的光密度为~1时，可获得最佳信噪比。 图10为各种发色团的附加浓度和细胞路径长度指南。

方便的是，样品浓度和细胞路径长度可以调整以考虑吸光度的限制。例如，如果样品吸光度太大，但为了实验目的不能降低浓度，可以缩短细胞路径长度以获得必要的测量。同样地，如果只有一个细胞路径长度可用，可以增加样品浓度以获得具有足够信噪比的数据。

除了路径长度的选择，比色皿或样品池的材料和体积也是进行圆二色性实验时需要考虑的重要参数。对于200纳米以下的测量，石英比色皿是必要的，因为它们在远紫外线下是透明的。虽然大多数石英矩形比色皿几乎没有双折射和平坦的基线，但应进行基线测量，以确保由于比色皿上的应变而没有观察到光学伪影。此外，这些细胞基线测量可以阐明细胞的清洁度。虽然可拆卸电池的体积比传统的1和10毫米路径长度的比色皿小得多，但这些电池不能用于与温度有关的测量，因为它们不是完全密封的，会导致热量损失。同样重要的是，在样品装入后要验证可拆卸电池的路径长度，以确保正确的路径长度，特别是在以后计算摩尔椭圆度或平均残留摩尔椭圆度时。矩形微电池可用于小体积测量，有各种体积和路径长度。JASCO还提供两种微量取样附件；一种是仅使用2或10毫升的光谱扫描盘，另一种是用于热稳定性研究的毛细管样品池。

溶剂的影响
样品所处的缓冲区或溶剂也会影响CD光谱。用于吸收测量的溶剂通常就足够了，然而在选择CD测量的溶剂时应考虑以下条件。(1) 溶解度，(2) 在被探测的波长范围内的透明度，(3) 光学不活跃，和(4) 样品的稳定性。条件2对于远紫外光下的二级结构研究特别重要，因为许多溶剂在200纳米以下有强烈的吸收，还有变性剂，如氯化胍和尿素。 在缓冲剂中加入盐类也会增加吸光度，并有可能引起散射，降低信噪比。以糖为基础的配方缓冲液不仅在远紫外光下吸收率高，而且还具有CD信号，应避免用于CD测量。

数字积分时间和扫描速度
数字积分时间或D.I.T.是指数据被积分的时间或探测器在将信号传输到A/D转换器进行处理之前收集光子的时间长度。D.I.T.的平方根与信噪比成正比，因此D.I.T.越长，信噪比越好。当样品的CD信号较小时，增加D.I.T.会有更大的影响，因为信号较少。

扫描速度决定了单色仪在指定的波长范围内扫描的速度，以获得指定数据间距的数据点。在连续扫描模式下使用时，扫描速度必须选择适当的D.I.T.，以防止测量的光谱出现失真。在选择D.I.T.和扫描速度时，可以使用以下准则

D.I.T. × Scanning speed< FWHM⁄3

其中FHWM是目标峰的一半峰高处的全宽。图12说明了扫描速度和数字积分时间对远紫外CD光谱的影响。

累积量
自动获得并平均在一起的光谱扫描的数量由累积量来指定。光谱信噪比与数字积分时间和累积次数的乘积的平方根成正比。虽然增加累积次数会提高信噪比，但也会增加测量采集时间。在选择累积次数和D.I.T.时，应考虑到基线漂移和峰宽的问题。

CD单位
CD光谱报告为椭圆度，θ，测量单位为mdeg，但可以根据用户的应用轻松转换。摩尔吸收率（∆ε）根据浓度和路径长度将圆二色光谱归一。

∆ε=εl-εr=∆A/(c∙l)=θ/(c∙l∙3298)

其中ε_l-ε_r是左(l)和右(r)圆偏振光成分在特定波长下的吸收程度的差异，∆A是吸光度的差异，c是浓度（mol/L），l是路径长度（cm）。
在分析二级结构成分时，必须考虑到蛋白质中氨基酸残基的数量，椭圆度被转换为平均残基摩尔椭圆度（MRME）。

〖[θ]〗_MR=(θ∙c∙l)⁄R

其中θ是椭圆度（mdeg），c是蛋白质浓度（mol/L），l是细胞路径长度（cm），R是蛋白质中的氨基酸残基数量。