用于研究分子相互作用的荧光寿命成像显微镜
发布时间：2023-09-01 09:58:58 阅读数： 143
荧光寿命成像显微镜（FLIM）已成为揭示复杂分子相互作用的变革性工具。通过利用荧光团揭示动态过程的独特能力，FLIM 揭示了细胞环境中隐藏的复杂性，为了解生物现象背后的基本分子相互作用提供了前所未有的见解。本文全面概述了 FLIM 及其在分子水平上的应用。
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什么是荧光寿命成像显微镜（FLIM）？
荧光寿命成像显微镜（FLIM）是一种先进的成像技术，它利用荧光团的荧光寿命来提供对分子动力学和相互作用的独特见解。荧光寿命是指荧光分子在发射光子并返回基态之前保持激发状态的平均持续时间。
荧光寿命不受浓度、吸收、样品厚度和光漂白等因素的影响，这增强了荧光寿命的稳健性，而荧光寿命对离子浓度、pH 值、分子结合和能量受体接近程度等环境参数的敏感性使其成为功能成像的理想选择。
FLIM 的功能扩展到利用佛斯特共振能量转移 (FRET) 传感器研究蛋白质与蛋白质或 DNA 与蛋白质之间的分子相互作用，有助于我们了解细胞信号传导和分子相互作用。
尽管 FLIM 过去很复杂，但最近的技术进步已使 FLIM 无需标记、速度更快、更易于使用，使其适用于研究细胞信号传导和分子相互作用。
如何植入 FLIM
FLIM 主要有两种实现方式：
时域荧光成像：在这种方法中，用短脉冲刺激样品，通过跟踪光子到达时间的直方图分组或通过脉冲采样或时间门控检测技术来评估衰减过程。在有多种荧光物种的情况下，它们的贡献会合并成一个统一的直方图。
频域荧光成像（FLIM）：每个光子都有一个相对于激发波的相位延迟，类似于到达时间直方图。在多个荧光物种的情况下，这种相位分布要经过傅立叶分析，以提取解调和调制参数，从而促进物种分离。
频域和时域 FLIM 都具有独特的优势和挑战。它们适用于不同的 FLIM 应用场景，如高动态范围成像、低光子预算成像和高时间分辨率成像。
FLIM 相对于传统强度成像的优势
强度成像可显示荧光团的分布，并可通过光谱特性加以区分，而 FLIM 则擅长区分分子环境或同一荧光团周围的类似光谱。例如，FLIM 可轻松区分各种细胞环境中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD(P)H），而基于强度的方法却很难做到这一点。
FLIM 对荧光团浓度的变化不敏感，能够区分量子产率和总体浓度的变化。它受内部滤光器效应的影响较小，是精确淬灭动态测量的理想选择。
FLIM 具有自参照功能，无需进行吞吐量校准，因此可在不同的设置中重复使用。此外，它还不受散射的影响，并能利用拟合程序对散射轮廓进行解释，从而确保即使在较深的穿透中也能保持精确度。
使用 FLIM 研究分子相互作用
氧气成像
FLIM 能够通过氧淬灭（一种降低荧光寿命的过程）测量细胞内的氧浓度。
这项技术在应用于荧光寿命较长的荧光团（如长寿命钌染料（t>800 ms））时特别灵敏。在基于 FLIM 的氧成像中，这些染料可作为有效的氧报告物，但需要专门的 FLIM 设备，以较低的脉冲重复率或极低的调制频率（千赫兹范围）运行。
通过 FLIM 增强大脑信号中的钙监测
钙离子（Ca2+）对大脑信号传导至关重要，而俄勒冈绿BAPTA-1（OGB-1）染料通过荧光寿命对纳摩尔[Ca2+]具有高灵敏度，因此能准确绘制神经元和星形胶质细胞中静息[Ca2+]的图谱。
在发表于《神经元》（Neuron）的一项研究中，Zheng 团队开发了一种先进的双光子激发时间分辨成像方法，利用 OGB-1 荧光寿命的高灵敏度来关联纳摩尔 Ca2+ 浓度。这项技术使他们能够快速获取数据，并提供不受各种因素影响的精确[Ca2+]读数。
与基于强度的方法相比，拟议的基于 FLIM 的方法克服了基于强度测量的局限性，提供了神经元和星形胶质细胞中基础[Ca2+]的高分辨率图谱。
该研究强调了 OGB-1 对微粘度、温度、pH 值波动以及 Mg2+ 和 Zn2+ 的适应性，使其成为一种基于生命周期的传感器，可用于跟踪脑片和体内的静息[Ca2+]。
利用共焦 FLIM 表征单个染料分子的分子动力学特性
发表在《单分子》（Single Molecules）上的一项研究重点介绍了固定在玻璃表面的单个染料分子的共焦荧光寿命成像显微镜（Confocal FLIM）。研究人员利用波长为 635 纳米的短脉冲二极管激光器，根据特定的荧光寿命研究了特定恶嗪染料和羰花青染料的时间分辨鉴定。
他们观察到单个分子荧光寿命和强度的波动（毫秒级分辨率），这归因于不同量子态（包括三重态）之间的跃迁，并与旋转和光谱跃迁相关。
这项工作引入了一种监测和了解分子水平动态过程的新方法，为了解单个染料分子的行为及其在表面上的相互作用提供了宝贵的见解。
蛋白质之间的相互作用
FRET-FLIM是一种先进的成像技术，它将FLIM与佛斯特共振能量转移（FRET）相结合，用于研究细胞分子间的相互作用。它在表皮生长因子受体（EGFR）研究中的应用提供了受体寡聚化和活化的详细信息。
FRET-FLIM 技术揭示了预二聚化受体，评估了表皮生长因子受体的磷酸化状态，并使受体活化在活细胞中的传播可视化。此外，包括 rFLIM 和 emFRET 在内的先进 FRET-FLIM 方法也为 ErB1 信号研究做出了贡献。
除了膜信号转导，FRET-FLIM 还揭示了下游细胞膜靶标，揭示了蛋白激酶 C (PKC) 信号转导、转录因子相互作用以及与疾病相关的蛋白质相互作用（如涉及 Rab-GTPases、淀粉样前体蛋白和破伤风毒素）中的分子事件。事实证明，这项技术有助于阐明各种细胞过程中错综复杂的蛋白质相互作用。
利用先进的 FLIM 技术同时对细胞中的多种 RNA 进行成像
活细胞中的 RNA 动态可提供有价值的生物学见解，通常是通过将荧光适配体标签与目标 RNA 进行基因融合来实现的。在努力提高 RNA 探针结合亲和力等特性的同时，人们对改进多路复用以同时可视化多个 RNA 种类的研究兴趣浓厚。
在发表于《自然-通讯》（Nature Communications）上的一项研究中，研究人员开发了一种名为 Riboglow-FLIM 的基于荧光寿命的 RNA 标记平台，以提高准确性并实现多种 RNA 的同时可视化。
通过采用源自细菌核糖开关序列家族的较小 RNA 标记，Riboglow-FLIM 提供了更好的对比度和多功能性。
这种方法使研究人员能够同时观察活细胞中两种不同的 RNA，这是以前的方法无法实现的挑战。
参考资料
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作者：Owais Ali
