细胞生物学中的延时显微技术

现代延时显微镜（TLM）已成为研究细胞生物学和细胞间相互作用的一种有效且逐步完善的仪器，其应用范围从分子和细胞生物学的基本方面到医疗实践。TLM 使科学家不仅能看到活细胞群体的动态和行为，还能看到这些群体中单个活细胞的动态和行为。本文将讨论延时显微镜在有效研究细胞动态方面的作用。
 

图片来源：OpturaDesign/Shutterstock.com

延时显微镜简介
延时显微镜（TLM）可描述为以固定间隔捕捉一系列显微图像的过程。传统显微镜拍摄的是细胞结构的静态图像，而延时显微镜拍摄的则是细胞的动态状态及其运作。

与活细胞成像和延时显微技术相关的最初工作可追溯到二十世纪初。通过延时显微技术进行实时成像的出现是一个关键性的突破，它克服了传统显微技术的一个重要限制，即薄而透明的样本需要组织固定，这阻碍了对同一样本中的活细胞和生物过程进行长时间的检查。

通过延时显微镜进行单细胞分段研究
延时显微镜是唯一能够直接捕捉单细胞水平上基本细胞过程的复杂动态和复杂性的精确技术，具有显著的时间精度。要有效利用单细胞延时显微镜，就必须在多个时间实例中自动分割和跟踪众多单个细胞。

细胞报告方法》（Cell Reports Methods）杂志的最新文章指出，单个细胞的分割和追踪仍然是一项挑战，特别是在分析延时显微镜图像时，尤其是在相位对比成像等流行的非侵入性成像模式下。近来，在物体分割和物体跟踪等任务中，深度学习（DL）已经超越了传统的基于规则的图像处理方法。

深度学习驱动的图像处理方法在细胞生物学和显微镜领域，特别是在使用超分辨率显微镜定位单个分子方面引起了人们的兴趣。研究人员已成功设计出一种灵活、可训练的 DL 模型，专门用于在单细胞水平上分割细胞体和跟踪哺乳动物细胞的延时显微图像中的细胞。

这种创新方法被命名为 "深海 "模型，有助于研究人员跟踪显微图像序列中的多种细胞表型和多个细胞分裂周期。它还能创建细胞系树结构。此外，训练有素的分割模型还能精确地参数化目标细胞的边界，并为其像素分配不同的颜色。这一过程有助于确定输入显微图像中每个细胞的形状和面积。

准确量化吞噬事件
吞噬是一种基本的细胞过程，细胞在此过程中会吞噬大量颗粒，包括微生物和其他细胞。这一过程具有多种功能，如营养、组织改造和细胞防御。然而，吞噬作用的特点是具有强烈的动态性，需要进行迅速而广泛的修改。

细胞科学杂志》上发表的文章指出，现有的吞噬量化技术主要依赖于间接或静态评估，如目标清除或染料吸收。因此，这些方法对吞噬率或目标处理的了解有限。加强对吞噬作用的动力学评估有可能为各个领域提供有价值的基本见解。

研究人员引入了一种动态成像方法，涉及活细胞、延时高内容显微镜。这种方法以识别和测量吞噬细胞内的荧光染料 "空隙 "为基础。利用这种技术，可以有效量化高效抗体依赖性细胞吞噬所必需的最佳靶细胞密度和抗体浓度。

此外，该研究还比较了空洞形成和染料吸收方法对吞噬作用的检测，同时还仔细研究了靶细胞吞噬和吞噬溶酶体处理之间的相互关系。

研究结果表明，这种方法有可能准确描述吞噬的各个阶段，以及吞噬过程中发生的形态变化，包括吞噬和靶细胞降解。这些成果为量化吞噬作用开辟了一条高分辨率的途径，从而为更好地理解这一基本生物过程背后错综复杂的细胞和分子连贯性开辟了道路。

将 TLM 和机器学习 (ML) 结合起来进行细胞动力学研究 
自动图像采集系统促进了显微实验的执行，产生了大量的图像数据集。然而，相当一部分显微技术只能提供强度图像，无法辨别所成像细胞带来的相位延迟。

为了解决这个问题，《生物医学光学杂志》上发表的一篇文章提出了一种在细胞转换过程中对细胞进行分类的方法。这种方法涉及延时定量相位成像（QPI），并已通过建立上皮-间质转化（EMT）模型系统，使用 Namru Mus musculus mammary gland（NMuMG）细胞系进行了验证。上皮-间质转化（EMT）是发育阶段和病理情况下发生的一个关键过程，在纤维化和伤口愈合中尤为明显。

在本实验中，细胞受到 TGFβ（10 ng/ml）的处理。经过 48 小时后，对照条件下的细胞保持上皮状态，而经 TGFβ 处理的细胞则转变为间充质状态。与传统的单时间点方法相比，结果数据显示，将时间信息纳入 EMT 期间细胞表型的新型分类模型可使准确率提高近 9%。这种方法有望加强对活细胞行为的自动监测。

TLM 对研究微生物群落的动态是否有效？
在微生物群落中，微生物种群之间错综复杂的相互作用会极大地影响群落的集体特征。这可能导致合作行为和共存，使所有相关方受益。

为了研究固体基质上细菌生物膜种群之间的相互作用，微生物学研究人员设计了一种方法。这种方法融合了显微精度、三维观察、独特的标记技术和长达 5 天的不间断成像等特点。这种被称为 BacLive 的方法由于采用了顶级的长工作距离浸入式光学器件而更加有效。

高质量的长工作距离物镜和玻璃底培养皿与荧光标记的细菌相结合，有助于获取大量数据。使用 BacLive 宏可以方便地管理这些数据。该宏可有效简化图像采集阶段的数据收集工作，从而简化后续的数据分析。

将这种方法与 Imaris、BiofilmQ 或 Comstat 等分析工具集成，有可能大大有助于探索活细菌的遗传过程。它还能让人们更全面地了解环境中普遍存在的无数相互作用。此外，这一策略在应用科学中也具有重要意义。

总之，延时显微技术在细胞生物学领域取得了巨大进步，有助于人们了解细胞内错综复杂的动态变化。随着技术的不断进步，延时显微镜的未来前景一片光明，有望进一步深入研究细胞尺度的复杂性。

参考资料

Zargari, A. et. al. (2023). DeepSea is an efficient deep-learning model for single-cell segmentation and tracking in time-lapse microscopy. Cell Reports Methods. Available at: https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2023.100500

Chu, C. et. al. (2020). High-resolution quantification of discrete phagocytic events by live cell time-lapse high-content microscopy imaging. Journal of cell science, 133(5), jcs237883. Available at: https://doi.org/10.1242/jcs.237883

Strbkova, L. et. al. (2020). Automated interpretation of time-lapse quantitative phase image by machine learning to study cellular dynamics during epithelial–mesenchymal transition. Journal of Biomedical Optics, 25(8), 086502-086502. Available at: https://doi.org/10.1117/1.JBO.25.8.086502

Molina-Santiago, C. et. al. (2022). A Noninvasive Method for Time-Lapse Imaging of Microbial Interactions and Colony Dynamics. Microbiology Spectrum, 10(4), e00939-22. Available at: https://doi.org/10.1128/spectrum.00939-22

作者：Ibtisam Abbasi