暗视野显微镜的优点和局限性

暗视野显微镜是1830年发明的一种技术，用于观察活的、未染色的细胞和微生物。这种类型的显微镜需要在黑暗的周围对样品进行强烈的照明，使其适合于研究特殊的样品。虽然它的局限性使其落后于更多的现代显微镜方法，但近年来，随着科学家们开始将其与其他方法一起使用，它已获得普及。

暗视野显微镜下的绿色浮游藻类Volvox群落，暗视野显微镜

暗视野显微镜下的绿色浮游藻类Volvox的菌落。图片来源：D. Kucharski K. Kucharska/Shutterstock.com

暗视野显微镜的原理
在暗视野显微镜中，一个不透明的圆盘被放置在聚光镜下方，确保只有来自标本的散射光可以到达眼睛。

在暗视野中，光线不是像其他形式的显微镜那样穿过标本，而是被载玻片上的颗粒所反射。光线的方向是使其以大角度通过聚光镜的外缘，并以斜角照射到标本上。

无论样本的颜色如何，图像通常在黑暗的背景下显示为明亮的白色。标本中的颜料被视为假色，因为它们在图像中被描绘成的颜色并不能准确反映物体的实际颜色。

暗视野显微镜的应用
暗视野显微镜与传统显微镜不同，产生不同风格的图像，适合不同的应用。并非所有传统显微镜的应用都适用于暗视野显微镜，也并非所有暗视野显微镜的应用都能与传统技术一样好地运作。

当研究人员需要观察未染色的透明标本时，暗视野显微镜是最有用的。一般来说，适合用暗视野显微镜观察的标本应具有与周围环境相似的反射指数。这样的折射率使得样本不适合用传统的明视野显微镜观察。

因此，观看水生生物的折射率与周围的水相似，已成为暗视野显微镜研究的标准样本。其他生物样本是这种方法的理想候选者，如细菌、组织培养物、酵母和其他。适合用暗力显微镜研究的非生物样品包括化学和矿物晶体以及聚合物的薄片。

因此，暗场显微镜已经成为微生物实验室的一个既定工具，用于各种应用，包括螺旋体的临床样品的可视化（如。Treponema palladium [梅毒]、Borrelia burgdorferi [莱姆病]和Leptospira interrogans [钩端螺旋体]），观察微生物运动（例如，观察细菌鞭毛），以及查看真核生物（例如，藻类和酵母）的内部结构。

暗视野显微镜的优点和局限性

优点

暗视野显微镜通常可以对不适合传统明亮显微镜的样品进行成像。与明视野显微镜相比，暗视野可以获得更大的分辨率，从而对样品进行更详细的成像。

与明视野显微镜相比，暗视野显微镜还能产生更好的图像对比度，而不需要对样品进行染色，因此，不会杀死细胞。

暗视野显微镜的另一个显著好处是不需要准备样品（例如，不需要染色），这减少了对过程的时间要求。

最后，暗视野显微镜不需要特别的设置或昂贵的设备，光照显微镜可以转化为暗视野显微镜，只需最低限度的额外费用。

局限性

虽然暗视野显微镜有许多基本的好处，但它也不是没有局限性。当对活体生物的湿标本进行观察时，必须迅速进行，以确保运动不会干扰图像的质量。

接下来，样品必须暴露在强烈的光照下，这可能会对样品造成损害，这取决于被成像的东西。

暗视野显微镜所需的光线强度也会导致眩光和失真。这些问题也使该技术在获得试样测量时不可靠。

暗视野显微镜的进一步限制包括其对污染物的敏感性。必须对标本幻灯片进行细致的清洁，以确保消除该区域的灰尘和污垢，这种污染会扭曲产生的图像。

同样地，标本必须没有灰尘和气泡，以确保高图像质量。

最后，标本必须是薄的。密集的样品会对产生的图像的对比度和准确性产生负面影响。出于这个原因，不是所有的样品都适合于暗视野成像。

最后的思考
虽然暗视野显微镜已经存在了一个多世纪，但它的局限性阻碍了它跟上其他显微镜技术的巨大进步，如相位对比和微分干涉对比（DIC）显微镜的能力。由于这个原因，该技术在现代成像中并不常用。然而，近年来，它已经越来越多地与现代方法相结合，如荧光显微镜。

参考资料

References and Further Reading

C Robert Bagnall. (2012) Dark Field Microscopy [Online]. UCI Department of Chemistry. Available at: https://www.chem.uci.edu/~dmitryf/manuals/Fundamentals/Dark%20Field%20microscopy.pdf (Last accessed October 2022).

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Written by

Sarah Moore