什么是共焦拉曼显微镜？(基础知识)

与其他光谱或光学显微镜技术相比，共焦拉曼光谱提供了许多显著的优势。

共焦拉曼显微镜
与其他光谱或可见光显微镜技术相比，共焦拉曼显微镜有许多显著的优势。首先，拉曼显微镜可用于对小范围内的未知化合物进行化学或分子分析，最小可达一微米。 第二，结合移动平台，拉曼显微镜可以绘制样品的区域图，对有图案或两个不同区域的样品很有用。 第三，拉曼可以进行深度剖析，使用户可以在不准备样品的情况下看到样品的层次。 拉曼显微镜是一个有用的工具，用于识别和绘制多层样品、矿物、颗粒识别和化学分布，仅举几个应用。

共聚焦拉曼显微镜原理
图1描述了共焦拉曼显微镜的一般布局。拉曼利用激光（a）作为光源，由于拉曼散射（辐照和反辐照转变）很弱，比典型的吸收光谱要弱一百万倍。分光器（b）将光分开，光束路径通过一个物镜（d）聚焦到样品（c）上。 光束可以在照相机（e）和分光镜（f）之间进行分割，分别用于观察或测量，在通过排斥滤波器以去除瑞利散射后，辐照（和反辐照）波长被光栅（g）衍射到探测器（h），可以是CCD或InGaAs阵列。

光谱分辨率
共焦拉曼显微镜系统的光谱分辨率是由几个因素决定的--光谱仪的焦距、光栅上的线数和检测器中元素的分辨率。焦距是指聚焦镜和检测器之间的距离，较长的焦距可以提供更大的分辨率，因为光的分离更宽（图2）。光栅是一个光学元件，由特定角度（闪光角）的周期性凹槽组成，以配合激发激光的波长。分辨率随着线数的增加而增加（图3），以表面上每毫米的线或沟槽来表示（常见的光栅是900克/毫米），以及闪光的波长。撞击光栅表面的光线按照惠更斯-菲涅尔原理被分散开来。探测器的元件数量也决定了分辨率，元件越多，分辨率越高，但灵敏度越低。

图2. 焦点和分辨率。
 

图3 光栅和分辨率。

空间分辨率
在共聚焦拉曼显微镜中，空间分辨率对于分辨样品中的微小结构差异极为重要。光学显微镜的物镜（最高放大倍数为x100）被用来观察样品，并将拉曼散射传到光谱仪上。这意味着许多影响光镜的因素和技术都可以应用于拉曼显微镜。空间分辨率受制于物镜的分辨力。显微镜测量的光斑大小取决于三个变量：样品的折射率（n），物镜的数值孔径（NA），以及入射光的波长（见图4）。 对光束腰部，或焦平面，体积的估计不包括散射光对样品的贡献或来自样品的贡献。

图4. 显微镜物镜和光斑尺寸。
激光器
激光波长的选择对于获得有意义的拉曼数据是很重要的；激发波长可以从紫外可见光到近红外光中选择，根据不同的应用，有一系列的功率选择。一个拉曼显微镜通常可以安装多个不同波长的激光器，以便对不同类型的样品进行数据测量（图5）。一个流行的激光波长是532纳米，因为它提供了相对较高的拉曼激发能量和低荧光。然而，为了更大程度地减少荧光，经常使用较长波长的激光器（引起较少的电子激发），如785纳米和1064纳米。不太经常需要的紫外激光器提供了 "共振拉曼 "的额外好处，对于碳质材料来说是一个很好的选择。

图5. 激光器的选择和应用。
剔除过滤器
拒绝滤光片是用来在探测激光的波长到达光谱仪之前去除或减少瑞利散射的。 有三种主要类型的滤光片：边缘、凹槽和低辐射滤光片（图6）。 边缘滤光片是最常用的，它既能拒绝瑞利散射，又能拒绝整个反斯托克斯区域。 强度通常>92%，截止点在100cm-1左右。如果还需要测量反斯托克斯区域，那么可以使用陷波滤波器，代价是强度（>80 %）和截止点（150 cm-1）。低辐射过滤器用于需要低文数的研究（5-50 cm-1的截止点），也有较低的强度（>80 %）。

图6. 拒绝滤波器。
检测器
检测器是拉曼显微光谱仪的一个关键部分。检测器将光子转换成可用的电子签名。电荷耦合器件（CCD）是一个由像素组成的晶格（图X，a），将光转换为电子信号。然后，这些像素在水平和垂直寄存器中被分档，数据被发送到计算机。CCD是拉曼光谱学中最常用的检测器。电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）的工作原理类似于普通的CCD，只是在垂直数据传输期间，信号在通过一种特殊材料时被倍增（图十，b）。这样做的结果是增益的50倍，允许更快的扫描（更短的积累时间）。砷化铟探测器使用砷化铟镓的线性阵列（与CCD中使用的网格相反）来探测近红外区域的光。这些探测器专门用于使用1064纳米激光的拉曼光谱。

共聚焦拉曼显微镜取样
荧光样品
荧光是拉曼测量中常见的副作用，可能发生在目标分子或周围的基质中。有三种物理方法可以减少荧光。第一种是选择一个不发生荧光的激光波长，这通常是在较长的波长（如785或1064纳米）。第二种方法是利用光圈的大小和形状来尽可能多地掩盖样品基质，以消除基质的荧光。第三种方法是将样品暴露在高瓦特下，直到基质不再发出荧光（光漂白）。 一个软件选项是使用荧光抑制算法，该算法能非常有效地去除较宽的荧光光谱，留下较清晰的拉曼峰，如图7所示，在一个干净的基线上。这个功能可以在测量过程中自动使用，以实现快速成像，或者在运行后进行更多的额外数据处理。当使用较短波长的激光器（如405或457纳米）时，这通常对具有强烈荧光的样品效果很好，因为这些激光器会产生更强烈的拉曼信号。

图7. 通过软件去除荧光。

矿物
在矿物分析方面，共聚焦拉曼显微镜比FTIR和XRD享有许多实际的好处。 许多矿物样品中的金属氧化物键在拉曼中具有高吸收性。 这些键出现在拉曼的200-1000cm-1光谱区。 虽然XRD可以识别多晶体），但它不能在微观层面上使用。 多晶体的拉曼带很容易区分，每个都给出了自己的代表光谱。图8显示了基底上金红石型和锐钛型TiO2纤维的拉曼图像。

图8. 通过拉曼测定的二氧化钛的多晶型。
多层样品
共聚焦拉曼显微镜可以用来确定多层样品的层次。 首先，可以制作一个样品的横截面，并在横截面上绘制样品图（图9）。 对于非常薄的层（<3 μm），由于其在XY方向的高空间分辨率，共焦显微镜是非常有效的。 薄层（<30 μm）可以在不准备样品的情况下通过共焦显微镜的深度剖析进行探测。 由于Z维度的散射光被过滤掉了，只需在Z方向上移动平台就可以获得Z方向的地图。

图9. 多层材料的横截面。
颗粒物
共焦拉曼显微镜的另一个应用是对小颗粒的分析。 这些颗粒可能是嵌入基体的包裹体，过滤器上的滤液，或基体上的颗粒。 尺寸范围从~1 μm及以上，取决于使用的激光和物镜。 现代软件/硬件现在可以找到表面上的颗粒，并通过库中的搜索自动标记它们。 图10显示了基质上的颗粒的这一过程。

图10. 基质上的颗粒的自动映射和识别。
化学制图
共焦拉曼成像的另一个应用是化学制图。 在样品表面的每个点进行扫描，并与资料库相匹配。 然后可以使用化学计量分析进一步分析数据，以提供样品的组成数据。 这可以通过使用快速制图平台和快速检测器进行快速分析而得到进一步加强（32,000个测量点，大约16分钟）。图11显示了一个拉曼图像，显示了一个药片中的成分。

图11. 片剂的拉曼图的化学分析。
差分干涉对比观察法（DIC）
差分干涉对比观察法（DIC）使用偏振光和诺玛斯基修正的沃拉斯顿棱镜来加强对低对比度图像的观察。DIC利用光的相位差来立体地观察亚微米级的非常小的阶差。诺玛斯基棱镜被用来从样品表面直接反射的两束光的差异中产生明暗对比。这种技术可以同样适用于表面有小的不平整的低对比度的生物和非生物样品，一个例子可以在图12中看到。

图12. 生物样品的DIC图像。
偏振光观察（PLO）
偏振光观察（PLO）利用各向异性的差异来加强对低对比度材料的观察。PLO使用位于被观察样品两侧光路中的两个偏振元件。它对诸如生物大分子和生物结构、矿物、陶瓷、矿物纤维、扩展聚合物、液晶等样品特别有用。 矿物样品的DIC可以在图13中看到。

图13. 矿物样品的PLO显示域。
探针
对于那些对显微镜来说太大的样品，或者要进行原位液体研究，可以使用拉曼探针。探针是由围绕核心材料的包层材料组成。当光从包层材料（η2）上反弹时，光在核心材料中经历全反射（η1），并形成一个接受锥（α）（图14）。光纤的数值孔径（NA）相当于sin（α）。由于每次内部反射都会损失一些光，所以较短的探头是可取的。