吉林大学研发新型Lipi-PS荧光探针，首创5D追踪开启细胞动力学新维度

最近发表在《先进科学》（Advanced Science）杂志上的一项研究介绍了一种名为Lipi-PS的超敏感波长荧光探针，用于增强超光谱荧光成像（HSFI）。该新型探针可实现对微环境极性的高分辨率映射，并通过五维（5D）追踪技术，在活细胞、组织及斑马鱼中实时追踪脂滴（LDs），该技术涵盖空间（三维或3D）、光谱及时间维度。  

该研究成果凸显了Lipi-PS作为光学生物成像领域的新标杆，其在亚细胞器水平上观察细胞内动态过程时，展现出了前所未有的高灵敏度。

荧光成像技术的发展

荧光成像在生物医学研究中具有重要意义，因其非侵入性和高灵敏度。传统方法，如宽场显微镜和共聚焦显微镜，虽然可提供结构信息，但往往缺乏对微环境的详细描述。

HSFI技术可在每个像素点捕获完整的荧光光谱，从而基于光谱位移分析微环境变化。然而，该方法受限于高波长敏感性荧光探针的可用性。常见染料如尼罗红在不同溶剂中的光谱位移极小（约7纳米），使其无法用于检测生物系统中的微小变化。

FLIM、HSFI 和本工作的概述。a) 荧光寿命敏感探针和 FLIM。b) 荧光波长敏感探针和 HSFI。c) HSFI 的优势和挑战。d) 具有波长超敏感特性的新型荧光探针Lipi-PS的开发及其在本工作中的 HSFI 应用。

开发增强极性敏感性的探针

该研究通过改变供体基团、π间隔基团和受体基团，合成了12种供体-π-受体（D-π-A）分子，以克服敏感性限制。荧光光谱和量子计算表明，π-间隔基在增强极性敏感性方面起主导作用。在候选化合物中，化合物12（具有荧烯π间隔基、苯并二噻吩四氧化物受体和NEt₂供体）实现了卓越的极性斜率（K_ps）值27.1，远超传统染料。

研究人员基于该支架开发了Lipi-PS，通过引入氰基苯基基团实现红光至近红外（NIR）发光，并通过烷基链实现选择性亲脂性靶向。Lipi-PS在550 nm处表现出强吸收，并具有卓越的溶剂色变发光特性，其发光波长从非极性己烷中的617 nm转移至极性二氯甲烷中的888 nm。这对应于极性斜率为29.8，约为尼罗红（4.9）的六倍，是目前已报道的极性敏感荧光探针中极性敏感性最高的。

计算轨道分析显示显著的电荷分离，突显了Lipi-PS对极性的高度敏感性。随着溶剂极性增加，π间隔基与受体之间的二面角减小，增强了π共轭并使发射波长发生偏移。此外，Lipi-PS在低极性溶剂中实现了38.6%的量子产率，这一数值对于在近红外窗口工作的染料而言极为突出。

不同基团对D-π-A型分子极性敏感性的影响。a–c) 采用不同受体、供体和π-间隔基团的D-π-A型分子。d,e) 分子1和12在不同有机溶剂中的归一化荧光光谱。f) 不同溶剂的极性指数E T (30) 值与分子1和12的荧光最大值之间的线性拟合。g–i) 荧光最大值从环己烷移动到氯仿，分子1至12在甲苯中的吸收最大值。

展示了光学敏感性和动态光谱成像

Lipi-PS探针在特异性、信噪比（SNR）和光稳定性方面优于传统LD染料如尼罗红。其信噪比达到 34.1±13.9，而尼罗红仅为 2.6±2.2，且在 100 次共聚焦扫描后仍保持超过 92% 的荧光强度。

研究人员通过结合波长扫描共聚焦显微镜与基于 MATLAB 的光谱解码技术，建立了 4 步 HSFI 极性映射技术。通过E_T(30)尺度将每个像素的发射光谱与溶剂极性相关联，实现了对微环境极性细微变化的定量映射。

在用极性改变剂处理的HeLa细胞中，HSFI显示胆固醇降低了脂滴极性，而油酸则增强了极性。脂滴大小相应发生变化，反映了胆固醇酯与甘油三酯之间组成的改变。

Lipi-PS 通过脂滴极性区分了癌细胞（HeLa、HepG2）和非癌细胞（HT22、7702），凸显了其在肿瘤诊断中的潜力。在小鼠肝组织中，HSFI 通过可视化健康与非酒精性脂肪肝疾病模型间的脂滴极性差异，显示疾病进展过程中极性降低及脂滴尺寸增大。

HSFI 在斑马鱼发育过程中以整体生物体水平追踪极性动态变化，揭示了器官特异性差异。一项特定应用涉及 3D单分子荧光光谱动态成像显微镜技术，实现了对活细胞中脂滴的5D 追踪。该方法捕捉了空间定位和光谱极性变化，表明在单个脂滴水平上存在动态组成变化和细胞内扩散行为。

π-间隔基的机理显著影响极性敏感性。a,b) 分子1和12在环己烷和二恶烷中的最佳基态和激发态构型。c,e) 分子1和12在环己烷和二恶烷中的Fs-TA光谱和相应的动力学拟合分析。d,f) 分子1和12在环己烷和二恶烷中的激发态转变路径。

光学应用在细胞和生物体模型中的广泛应用

Lipi-PS 强大的光谱敏感性使其能够通过可视化脂滴中的生化变化，实现精确的亚细胞极性映射。它根据脂质组成和极性区分肿瘤组织与非肿瘤组织，展现出在疾病诊断方面的强大潜力。Lipi-PS支持5D成像，可实现细胞和斑马鱼中细胞器运动及微环境变化的实时追踪。其光稳定性、近红外发射特性和低细胞毒性使其成为长期活细胞组织成像的理想选择。

通过克服HSFI在波长敏感性方面的关键限制，Lipi-PS成为极性敏感探针的标杆。其将光谱位移与脂滴组成相关联的能力，为研究脂质代谢和疾病进展开辟了新方向，例如非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和发育生物学。将 HSFI 与超分辨率技术（如受激发射耗尽（STED）显微镜）相结合，可进一步提升高分辨率生物成像能力。

目标荧光探针Lipi-PS的合理设计及其光物理性质。a) Lipi-PS的分子设计策略。b) Lipi-PS在不同有机溶剂中的归一化荧光光谱。c) 不同溶剂的极性指数E T (30)值与Lipi-PS对应的荧光最大值之间的线性拟合。d) Lipi-PS在c-己烷和二氧六环中的最佳基态和激发态构型。e) Lipi -PS在c-己烷和二氧六环中激发态的转变路径。

结论与未来方向：光学生物传感

Lipi-PS 确立了极性敏感荧光探针的新标杆，克服了此前限制 HSFI 敏感性的技术瓶颈。其高量子产率、长波长发射、强双光子吸收及优异的光稳定性，解决了生物成像领域的关键挑战，实现了对亚细胞水平生理及病理过程的精准实时可视化。

Lipi-PS特制 HSFI ：单 LD xyzλt五维动态追踪。a) 3D-SpecDIM 系统光学布局。b,c) HeLa 活细胞单 LD 的 3D 轨迹和波长变化：对照组（左）和刺激组（右）。3D 轨迹由xyz位置随时间的变化积分而成。波长信息被编码成伪彩色并显示在 3D 轨迹中。d) 单 LD 的发射波长、极性、平均扩散系数和平均扩散位移的统计结果：对照组和刺激组在不同阶段（BC：变化前；CP：变化过程中；AC：变化后）。星号表示T检验中的P值。

Lipi-PS 在跨细胞、组织和整个生物体中绘制脂滴极性的成功应用，凸显了其在生物医学研究中的多功能性。这一进展提升了 HSFI 的能力，并为研究脂质代谢和细胞微环境动力学开辟了新方向。探针化学的持续发展和 Lipi-PS 的采用将使 HSFI 成为生物医学光学和生命科学领域有用的工具。

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