一个光子一个光子地构建图像，增加显微镜提供的信息内容

一种新开发的紧凑型ISM显微镜配备了单光子雪崩二极管(SPAD)阵列探测器，提供高分辨率的结构和功能成像。来源:A. Zunino (ITT)。由于快速和紧凑的探测器阵列的出现，激光扫描显微镜的世界正在迅速发展。这些阵列取代了传统共聚焦激光扫描显微镜中典型的单元素探测器，实现了新的独特功能。

传统的探测器只提供收集光的强度值，而像素化探测器还允许记录入射光的空间分布，有效地为每个扫描点建立照明区域的小图像。探测器阵列提供的额外空间信息使一种称为图像扫描显微镜(ISM)的超分辨率技术成为可能。ISM通过计算从显微镜产生的原始多维数据集中构建单个图像。与传统共聚焦显微镜相比，最终图像具有更好的信噪比(SNR)、光学切片和空间分辨率。

详细地说，ISM图像的横向分辨率可以超过阿贝的限制，可达两倍。然而，这些优势只能通过利用空间信息来实现;现代荧光生物成像可以通过时间分辨采集进一步丰富，这使得可以访问编码到荧光动力学中的结构和功能信息(例如荧光寿命)。

最近，位于热那亚的意大利理工学院(IIT)的研究人员开发了一种紧凑而有效的ISM显微镜，该显微镜配备了一个单光子雪崩二极管(SPAD)阵列探测器，能够在单一架构中提供高分辨率的结构和功能成像。这项研究发表在《先进光子学》杂志上。

所述SPAD阵列探测器包括排列在正方形网格中的25个独立二极管。小尺寸和异步读出能够快速检测撞击的荧光光子。该数据采集方案基于数字频域(DFD)方法，是一种外差采样技术，可以构建荧光衰减直方图，时间分辨率低至400ps，适合大多数荧光成像应用。

(a) HeLa细胞微管蛋白丝的共聚焦和ISM荧光寿命图的比较。(b)微管细丝的原始STED和ISM-SPLIT-STED图像的比较。(c)两种染料的相量表示，具有相同的寿命和重叠的激发光谱，分别由两个不同的激光脉冲激发(上)。两种染料混合贡献的相量表示(底部)。(d)使用时间门控(左)和相量分离(右)的通道分离。由于串扰，只有相量分离才能成功地区分两种染料。资料来源:Tortarolo, Zunino等人，doi 10.1117/1.AP.6.1.016003.

该技术非常简单，可以在同一块FPGA(现场可编程门阵列)板上进行直方图计算，用于控制显微镜并记录检测到的信号，简化了显微镜结构。

由于SPAD阵列探测器提供了独特的时空信息，作者展示了荧光寿命(FL)测量与ISM (FLISM)的结合。除了传统的ISM优势之外，FLISM图像的信噪比提高了，可以实现更稳健的荧光寿命估计。

该报告强调了显微镜的多功能性，结合了ISM和时间分辨测量与受激发射损耗(STED)显微镜，使用寿命调谐分离(SPLIT)技术。结果是在不修改采集方案的情况下获得具有增强的横向分辨率和对比度的图像。此外，时间分辨率的测量可以使用单个探测器进行多物种成像，以增加结构特异性。由于荧光动力学的相量表示，该系统可以区分不同的染料的荧光寿命值。即使使用寿命值相近、激发光谱重叠的染料，利用脉冲交错激发技术也能区分不同的荧光团。

实际上，通过不同颜色激光的交替激发脉冲，光谱信息被有效地编码到时间维度中。由于所提出的显微镜具有优异的时间分辨率，两种荧光染料的贡献可以随后分离以避免串扰。

IIT分子显微镜与光谱学实验室首席研究员、通讯作者Giuseppe Vicidomini表示:“这项工作的结果表明，激光扫描显微镜的未来与SPAD阵列探测器紧密相连，能够在不改变共聚焦显微镜光学结构的情况下，用额外的空间和时间信息丰富显微镜数据集。”

工作表明，SPAD阵列探测器与定制的采集系统相结合，使光子分辨ISM易于访问和使用。