用于分析癌细胞的激光差分共聚焦拉曼-布鲁因光谱显微镜
发布时间：2023-07-10 08:00:00 阅读数： 116
(a)示意图配置。(b) 仪器配置。资料来源：邱立荣，苏云浩，徐克美，崔瀚，郑德志，朱元敏，李林，李芳，赵维谦
癌细胞与正常细胞在形态、化学特性和机械特性方面存在明显的差异。对肿瘤组织的细胞化学和机械性能的检测可以为细胞和人体组织的病理过程提供多维信息。
在现有的对组织和细胞的形态、力学和化学性质的检测方法中，共聚焦拉曼光谱可以不接触、不标记地检测样品微区的化学性质，而共聚焦布里渊光谱可以不接触、无损地检测样品微区的力学性质。
将共聚焦拉曼光谱与布里渊光谱相结合，同时在原位检测组织微区甚至亚细胞结构的三维形态、化学特性和力学特性，有望为检测组织和细胞的多维度病理信息提供新的手段。
现有的共聚焦拉曼/布里渊光谱显微成像技术缺乏高精度的实时聚焦能力，因此在扫描过程中聚焦在样品上的光斑大小随样品的波动而变化，从而制约了共聚焦光谱显微系统理论空间分辨率的实现。
其次，由于拉曼和布里渊散射光谱较弱，积分时间较长，共焦光谱显微镜容易受到系统漂移的影响而导致散焦，从而影响空间分辨率和成像质量。此外，当它被用于生物组织切片样品成像时，垂直入射产生的荧光信号降低了样品拉曼光谱的信噪比。因此，这影响了拉曼光谱和布里渊光谱检测的准确性，降低了检测精度。
在发表于《光科学与应用》的一篇新论文中，由北京理工大学赵维谦教授领导的科学家团队提出了一种新的分光圈激光差分共聚焦拉曼-布里渊光谱显微镜（DLDCRBSM），具有高稳定性、高分辨率、抗散射能力。
将分光圈激光差分共聚焦显微镜与拉曼光谱和布里渊光谱相结合，利用差分共聚焦显微镜实现样品的纳米级精确聚焦，提高空间分辨率和稳定性、 采用分光圈技术，有效抑制了散焦层杂散光和反射光的干扰，提高了信噪比；采用共轴激发和高分辨率分离检测，实现了对同一区域的几何形貌、拉曼和布里渊光谱的高稳定性和高空间分辨率的同步成像。
(a) 样品倾斜时DLDCRBSM和共聚焦拉曼系统（CRM）的测试结果。在聚焦能力下，DLDCRBSM的制图结果是清晰的（上图）。如果没有聚焦能力，传统的CRM/共焦布里渊显微镜的制图结果是模糊的（下图）。(b) 与传统的CRM相比，DLDCRBSM在空间上分离了拉曼光谱的激发光路和收集光路，在轴向的焦点区域大小被压缩。因此，该系统可以抑制散焦层中杂散光的干扰。资料来源：邱立荣，苏云浩，徐克美，崔瀚，郑德志，朱元敏，李林，李芳，赵维谦
基于所提出的方法，开发了具有高空间分辨率和三维成像聚焦和跟踪能力的分光圈微分共聚焦拉曼-布鲁因光谱显微镜。它的轴向聚焦精度为1nm，光谱图像横向分辨率优于400nm，拉曼光谱检测分辨率为0.7cm-1，布里渊光谱检测分辨率为0.5GHz。
所建立的显微镜用于硅基上的条状聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）样品，由于其轴向实时聚焦，获得了样品的清晰图像。因此，它验证了所提出的方法具有抗漂移能力。该显微镜用于上层为PMMA、下层为SiO2的双层透明样品，测量结果表明，该显微镜具有抑制失焦杂散光干扰的能力。
利用开发的差分共聚焦光谱显微镜，对胃癌组织和邻近的正常组织进行了拉曼和布里渊绘图。结果证实了之前的假设：癌组织中蛋白质物质的变化和组织粘弹性的变化导致了侵袭性的增加。
图3. (a) 各种化学成分在胃癌组织和邻近正常组织的扫描区域的三维分布图。(b) 胃癌组织和邻近正常组织扫描区域的损失模量和储存模量的三维分布图。布里渊光谱的频移和半最大值全宽分别代表物质的储存模量（弹性）和损失模量（粘度）。资料来源：邱立荣，苏云浩，徐克美，崔瀚，郑德志，朱元敏，李林，李芳，赵维谦
图3(a)是该差分共聚焦光谱显微镜对胃癌组织及其相邻正常组织的化学成像结果，浓度是由拉曼光谱的特征峰的强度来表征的。
与相邻的正常组织相比，胃癌组织中胶原蛋白的浓度较低，且分布不均。胃癌细胞中DNA物质的浓度高，分布范围广。胃癌组织的细胞基质中的蛋白质浓度较低。胃癌组织中的脂质浓度在基质内很高，而正常组织中的脂质分布相对均匀。
图3(b)显示了差分共聚焦光谱显微镜对胃癌组织和邻近正常组织的机械性能的成像结果。布里渊光谱的频移代表物质的储能模量（即弹性），而布里渊光谱的半最大值全宽代表物质的损失模量（即粘度）。与邻近正常组织的力学成像结果相比，胃癌细胞和细胞间物质的弹性较低，而癌细胞核的弹性较高。胃癌细胞和细胞间质的粘性较低，而癌细胞核的粘性较高。
本研究提出了一种具有高稳定性、高分辨率和抗散射的激光差分共聚焦拉曼-布鲁因光谱成像方法，并成功研制了相应的仪器，检测了样品的三维形态、力学性能和多维信息，并用于肿瘤组织的表征分析，验证了其应用效果。该方法可为癌症过程研究和癌症治疗提供一种新的方法。
参考资料
Lirong Qiu et al, A high-precision multi-dimensional microspectroscopic technique for morphological and properties analysis of cancer cell, Light: Science & Applications (2023). DOI: 10.1038/s41377-023-01153-y
