显微镜技术结合创造出更强大的成像设备

Idler和DFG红外激光器的功率输出。使用热电堆功率计（919P-003-10，Newport）测量激光器输出的功率。覆盖了800至4800 cm-1（2.1-12 μm）之间的所有文数。根据制造商（APE Angewandte Physik & Elektronik GmbH, Berlin, Germany），脉冲宽度为2 ps，带宽为8-10 cm-1。资料来源：《自然-光子学》（2023）。DOI: 10.1038/s41566-023-01243-8

如果你想象自己通过显微镜来观察，你可能会想象自己在玻璃片上看到一个变形虫，或者可能是一个人类细胞，甚至可能是某种小昆虫。

但是显微镜能看到的东西远不止这些小生物，而加州理工学院开发的一种新型显微镜正在使我们更容易看到构成生物的分子。

在《自然-光子学》杂志上发表的一篇论文中，来自化学助理教授和遗产医学研究所调查员Lu Wei实验室的研究人员展示了他们所谓的键选择荧光检测红外激发光谱显微术，或BonFIRE。

BonFIRE将两种显微镜技术结合成一个过程，具有更大的选择性和敏感性，使研究人员能够在前所未有的单分子水平上观察生物过程，并从分子的角度理解生物机制。

"研究报告的共同作者、化学工程研究生Dongkwan Lee说："有了我们的新显微镜，我们现在可以用振动对比来观察单分子，这在现有技术中是具有挑战性的。

BonFIRE涉及的一项技术是荧光显微镜，它通过给分子和其他微观结构贴上荧光化学标记来成像，使它们在成像时发亮。
 

博士后学者Haomin Wang（左）和研究生Dongkwan Lee（右）演示BonFIRE显微镜仪器的操作。资料来源：加州理工学院
另一项技术是振动显微镜，它利用了将分子中的原子结合在一起的自然振动。要成像的样品被光轰击，在这种情况下是红外光。这种轰击导致材料分子的键以这样一种方式振动，从而可以确定其类型。例如，三键的振动将 "听起来 "与单键的振动不同，一个碳原子与另一个碳原子结合的振动将听起来与一个碳原子与氮原子结合的振动不同。这与训练有素的吉他手仅通过听其发出的音就能分辨出吉他上的哪根弦被拨动以及它是由什么材料制成的并无不同。

Wei说，荧光显微镜允许研究人员观察单分子，但它并不提供丰富的化学信息。另一方面，振动显微镜提供了丰富的化学信息，但只有当被成像的分子大量存在时才能发挥作用。

BonFIRE通过将振动与荧光耦合，有效地结合了两种技术的优势，从而绕过了这些限制。这个过程是这样的： 样品首先被一种荧光染料染色，这种染料与要成像的分子结合。然后，样品被红外光脉冲轰击，其频率被调整为激发该染料中的一个特定键。一旦该键被该光的单个光子激发，第二个更高能量的光脉冲就会照到它，并激发它发出可被显微镜检测到的荧光。通过这种方式，显微镜可以对整个细胞或单个分子进行成像。

"我们对这种光谱学过程非常着迷，并为将其转化为现代生物成像的新型工具而感到兴奋，"研究的共同作者、化学博士后学者研究助理王浩民说。"在过去的三年里，我们一直在冒险建立我们的定制BonFIRE显微镜，并对这个光谱过程有了更深的了解，这进一步帮助我们优化了我们设置中的每个组件，以达到我们现在的性能。"

在他们的论文中，研究人员还展示了用 "颜色 "标记生物大分子的能力，使它们能够彼此区分开来。这是通过使用构成染料分子的原子的几种同位素来实现的。(同位素是一种元素的形式，具有不同的原子量，因为它们的原子核有更多或更少的中子）。它们的键的振动频率随着原子质量的增加或减少而变化。

"与传统的荧光显微镜不同，它一次只能区分少数几种颜色，BonFIRE使用红外光来激发不同的化学键，产生彩虹般的振动颜色，"Wei说。"你可以从同一个样品中一次标记和成像许多不同的目标，以惊人的细节揭示生命的分子多样性。我们希望在不久的将来能够在活体细胞中展示数十种颜色的成像能力。"

其他共同作者是化学系研究生曹雨露、毕晓天、杜佳俊和苗坤。

参考资料

Haomin Wang et al, Bond-selective fluorescence imaging with single-molecule sensitivity, Nature Photonics (2023). DOI: 10.1038/s41566-023-01243-8