通过连续成像实现新的分辨率提升

在慕尼黑路德维希-马克西米利安大学（LMU），一个由物理学家Ralf Jungmann领导的研究小组正在利用一种新方法，将荧光显微镜的分辨率提高到埃斯特伦尺度--大大低于传统光镜的分辨率极限。

RESI可以使显微镜的长度尺度达到埃格斯特罗姆的分辨率，甚至可以达到DNA中两个相邻碱基之间的距离。图片来源：Max Iglesias

LMU和马克斯-普朗克生物化学研究所（MPIB）的Ralf Jungmann教授的研究小组能够在荧光显微镜方面取得新的发现。该小组提出了 "序列成像分辨率增强法"（RESI），这是一种革命性的方法，可以将荧光显微镜的分辨率提高到Ångström级别。

这一创造有望为研究生物系统的方法带来范式的转变，其细节迄今为止是无可比拟的。

众所周知，细胞是生命的基本单位，由大量复杂的结构、过程和机制组成，支撑着生命系统并使之延续。一些细胞的核心成分，如RNA、DNA、蛋白质和脂质，只有几纳米大小。

这使得它们与传统光镜的分辨率限制相比要小得多。因此，这类分子和结构的正确组成和排列经常是未知的，导致对生物学的基本概念缺乏机械性的理解。

在过去的几年里，超分辨率方法创造了跨越式的发展，可以在经典的光的衍射极限以下解决几个亚细胞结构。单分子定位显微镜，又称SMLM，是一种超分辨率方法，有可能通过时间上隔离其荧光发射来解决10纳米大小的结构。

由于单个目标在不同的黑暗视野中随机地亮起（它们眨眼），它们的位置可以以亚分度的精度被识别。由Jungmann小组发明的DNA-PAINT是一种SMLM方法，它利用染料标记的DNA "成像器 "链与它们的目标结合的互补体进行瞬时杂交，以获得超分辨率所必需的闪烁。但到目前为止，即使是DNA-PAINT也无法解析最小的细胞结构。

RESI可以用任何标准的荧光显微镜来应用
在本研究中，由共同第一作者Susanne Reinhardt、Luciano Masullo、Isabelle Baudrexel和Philipp Steen与Jungmann共同领导的团队启动了超分辨率显微镜的新方法，从根本上实现了 "无限 "空间分辨率。

这种新方法被称为 "通过连续成像提高分辨率"，简称RESI，它利用了DNA-PAINT的潜力，通过特殊的DNA序列对目标进行编码确定。

通过标记相邻的目标，这些目标相互之间太过接近，甚至无法用不同的DNA链进行超分辨率显微镜分析，一个额外的区分度（条形码）已经开始进入样品。

通过依次对第一个序列和另一个序列（从而也是目标）进行成像，它们可以被毫不含糊地分离出来。

最重要的是，由于它们是按顺序成像的，目标可以任意靠近，这是其他方法无法解决的问题。此外，RESI不需要专门的仪器，它可以在任何标准荧光显微镜的帮助下使用，从而使几乎所有的科学家都能轻松地使用它。

为了说明RESI在分辨率上的飞跃，研究小组为自己设定了解决生物系统中最小的空间距离之一的困难： 单个碱基与DNA双螺旋之间的隔离，其间隔不到1纳米（十亿分之一米）。

通过设计一个DNA折纸纳米结构，使其表现出从双螺旋中以一个碱基对的距离伸出的单链DNA序列，并进一步对这种单链按顺序成像，研究小组解决了相邻碱基之间0.85纳米（或8.5埃恩斯特伦）的距离，这是先前无法想象的壮举。

科学家们完成了这样的测量，其精确度为1埃恩斯特伦，或百亿分之一米。这有助于强调RESI方法无可比拟的能力。

"生物研究的游戏规则改变者"
重要的是，该方法是通用的，不限于DNA纳米结构的应用。为此，该团队分析了利妥昔单抗的分子作用模式，利妥昔单抗是一种抗CD20的单克隆抗体，最初于1997年被批准用于治疗CD20阳性血癌。

但是检查这种药物分子对分子受体模式的影响已经超出了传统显微镜方法的空间分辨率能力。理解这种模式是否以及如何改变健康和疾病以及治疗时的情况，不仅对基本的机理研究有意义，而且对开发新的靶向疾病治疗方法也有意义。

在RESI的帮助下，Jungmann和他的团队能够披露CD20受体在未经处理的细胞中作为二聚体的自然排列，并揭示CD20如何在药物治疗后重新排列成二聚体链。目前，单蛋白水平的知识有助于深入了解利妥昔单抗的分子作用方式。

由于RESI是在完整的细胞中执行的，该方法填补了X射线晶体学或低温电子显微镜等纯结构方法与传统的低分辨率全细胞成像方法之间的空白。

Jungmann和他的研究小组相信，"这种前所未有的技术不仅对超分辨率，而且对整个生物研究都是一种真正的游戏规则改变"。

参考资料：Reinhardt, S. C. M., et al. (2023) Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature. doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9.