双光子显微镜系统可观察到快速的生物过程

突破性的激光扫描设计开启了每秒高达10,000帧的高精度观察，从而使该显微镜成为一个强大的记录工具。

通过结合两种激光扫描模式，研究人员开发了一种多功能的双光子显微镜系统，可用于以高帧率和空间分辨率观察极快的生物过程。图片来源：Li等人，doi 10.1117/1.NPh.10.2.025006
生物学领域已经被双光子显微镜（TPM）彻底改变，使科学家能够以高分辨率注意到活体组织中复杂的生物过程。与传统的荧光显微镜方法相反，TPM利用低能量的光子来刺激荧光分子进行观察。

反过来，这使得进入组织的可行性更强，并保证荧光分子或荧光团不会受到激发激光的永久性损害。

但是，很少有生物过程过于迅速而无法被记录，即使有复杂的TPM。限制TPM性能的设计参数之一是线扫描频率，量化为每秒帧数（FPS）。这关系到目标样品在一个方向上被激励激光一起扫过的速度（例如，在水平扫描中）。

另外，缓慢的扫描频率也会影响系统的整个FPS，因为它确定了激光可以在另一个方向上扫过的速度，也就是说，在垂直扫过时。总的来说，这些在显微镜的时间分辨率和观察框的大小之间做出了权衡。

围绕这个问题，一个来自中国和德国的国际科学家小组最近提出了一个强大的TPM设置，具有独特的高线扫描频率。

根据他们在《神经光子学》杂志上的报告，这个显微镜系统是为以高时间和空间分辨率对快速生物过程成像而开发的。

建议的TPM区别于传统TPM的主要因素之一是使用声光偏转器（AODs）来调节激发激光的扫描。AOD是一种独特的晶体，其折射率可由声波精确调节。

反过来说，这使人们能够根据需要将激光束重新定向通过它。更重要的是，与传统TPM中使用的电流计相比，AOD允许更快地进行激光转向。

因此，该团队在二氧化碲（TeO2）晶体的帮助下，开发了一种定制的AOD，具有非常高的声速，从而有助于实现高线扫描频率。

有了这种AOD，激光器有可能在短短的2.5μs内扫描框架中的一条线，相当于400kHz的最大线扫描频率。以同样的方式，该团队利用AOD在另一个方向上获得合理的慢速扫描频率。

为了进一步提高其显微镜的适应性，该小组在必要时增加了转向基于振镜的激光扫描机制的选项。这使得他们能够以可接受的速度和分辨率扫描样品的大面积区域，从而在切换到AOD扫描之前更容易发现感兴趣的小区域。

该团队使用新设计的TPM进行了各种概念验证实验。在遗传工程小鼠上安装了颅骨窗，并利用它来记录神经元的活动和形态，以及单个红细胞（RBC）的运动。

该系统使用适当的帧大小和AOD配置，获得了高达10,000 FPS的帧率。这足以准确地量化钙在神经元树突中传播的速度，以及设想血管内独立红细胞的运动轨迹。

基于AOD的扫描显微镜的新系统代表了成像速度和性能的大幅提高，这在其应用于体内钙信号传播和大脑血流测量中得到了证明。

Na Ji博士，《神经光子学》副主编和加州大学伯克利分校实验物理学Luis Alvarez纪念讲座教授

在未来，新的概念验证TPM设计将使快速捕捉生物过程变得可行，并可大大增强他们对生物过程的理解。
参考资料：Li, R., et al. (2023) Ten-kilohertz two-photon microscopy imaging of single-cell dendritic activity and hemodynamics in vivo. Neurophotonics. doi.org/10.1117/1.NPh.10.2.025006.