什么是共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）？
发布时间：2023-03-10 08:00:00 阅读数： 334
共焦显微镜是一种光学成像技术，它依靠空间滤波方法来消除样品中没有立即对焦的区域对图像的贡献。
与同时照亮整个样品区域的传统显微镜方法不同，共焦显微镜使用聚焦在样品上的激发光束，然后依靠检测产生的荧光来重现样品的图像。
大多数现代共聚焦显微镜使用激光束作为样品的激发源。
入射光线从一个镜子组件中反射出来并聚焦到样品上。
然后，所产生的荧光通过空间针孔过滤器，以去除样品中失焦区域的任何荧光贡献。
然后，镜子组件可以被转换，以扫描整个样品的光束，并建立一个更广泛的空间或深度轮廓。这就是为什么共聚焦显微镜最常见的变化之一被称为激光扫描共聚焦显微镜。
共聚焦显微镜的主要优点是能够从以标准荧光显微镜的方式准备的样品中重建三维荧光图像。
除了用于细胞结构的三维重建外，图像信息还可以被记录为时间推移，以观察细胞行为的时间演变。
然而，共焦显微镜的主要缺点之一是，由于需要在样品上进行光束的光栅扫描，图像采集可能很慢。
许多共焦显微镜的焦斑尺寸将被有意缩小，以达到最佳的空间分辨率，这将进一步增加扫描时间。对于拍摄三维剖面图，这个问题会进一步加强，因为需要获取多个焦距深度的二维图像。
共聚焦显微镜可以对更厚的样品进行成像，而不是严格的基于透射的方法和样品。通常情况下，50微米左右的样品厚度是理想的，尽管使用该方法对更厚的样品是可能的。
用共聚焦显微镜成像的典型物种包括细胞和组织，用于形态学和动态分析。
共聚焦显微镜可实现的最高空间分辨率约为横向180纳米，轴向500纳米--不需要额外的步骤来纠正图像畸变。5 这对于许多生物应用和更普遍的纳米材料和材料开发的一些应用来说是足够的。
共焦显微镜的用途是什么？
共焦显微镜的一个重要应用是在组织学领域。
组织学和组织病理学涉及观察生物组织的异常和变异，以确定与疾病有关的细胞变化。
组织学不仅作为医学诊断工具，而且确定疾病的治疗目标和了解参与疾病进展的细胞机制，都是有益的。
通过组织学研究可获得的大量信息可用于对肿瘤的严重程度进行分级，并确定一种新药是否与正确的目标区域相互作用。
共聚焦显微镜是观察皮肤样本的组织学研究的一个特别强大的工具。8 通常在反射模式下使用近红外激光源进行此类研究，皮肤中的物种，如黑色素和角蛋白会发出强烈的反射信号。这些信息可以区分良性和恶性的皮肤病变，从而进行快速和准确的诊断。
共焦显微镜在细胞生物学中的其他应用包括眼科。10 从评估角膜厚度到神经密度和角膜细胞密度，共焦显微镜是用于眼科样本的理想方法，因为它不需要额外减薄。
在正确的焦距设置下，可以使用全厚度的角膜样本。因此，有可能建立起感兴趣的样品中各种物种分布的深度和密度曲线。
带狭缝灯的共聚焦显微镜对生物样品的另一个优点是，可以用来控制样品的光散射量。10 样品的过多散射和不需要的荧光会导致该方法可实现的空间分辨率模糊。
共聚焦显微镜的发展
正在通过硬件实现或后处理方法开发一些方法，以提高共焦显微镜测量中可实现的空间分辨率。
更亮的光源也使更多的多光子成像方法成为可能，这可以克服特定波长的光对生物样品的渗透深度的一些问题。
共聚焦显微镜的一个非常活跃的发展领域是朝着超分辨率方法发展，使空间分辨率小于所使用的光的波长的衍射极限11。
特别是在医学应用方面，机器学习算法和自动扫描及聚焦程序的使用正在被用来克服缓慢扫描速度的限制，或者通过图像采集程序的完全自动化或尽量减少完整的三维重建所需的图像数量。
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Written by Rebecca Ingle, Ph.D
