C波段紫外线消光显微镜的无标签超强对比度

一种新的专用显微镜已经被开发出来，它利用紫外光的复杂特性来提高图像分辨率和对比度。大多数细胞在可见光波长下是透明的，这意味着它们的复合折射率的虚数部分，也被称为消光系数，接近于零。

然而，在紫外线区域的c波段，消光系数自然要比可见光波段高得多。使用新的紫外兼容显微镜和相关的图像处理，可以对传统上不可见的生物样本特征进行对比度极好的、高分辨率的、无标签的显微观察。

使用高分辨率明视野显微镜对细胞规模的生物研究至关重要，但由于图像对比度低，这种技术有局限性。在样品上使用染料可以产生很好的对比度，但这需要额外的时间和精力，并可能改变细胞的自然结构或功能。因此，内在的对比度方法是可取的--最好是能提供定量信息的方法。

这种方法的一个新的候选者涉及到使用c波段的紫外线（UVC）光，由于UVC较低的穿透深度、较大的吸收和较高的特异性，它既能提高图像对比度，又能提供生物样品的固有深度切片。这种方法提供了可视化细胞内小结构的可能性，这些小结构接近但高于分辨率极限，而且往往无法用传统的明场显微镜检测到。

利用计算性定量相位显微镜（QPM），这种新方法可以提取并分离样品图像的数值实部和虚部。由于细胞的消光系数与虚相信息有关，通常非常小，对图像对比度的贡献很小，传统的定量相位显微镜通常会忽略这个成分。

然而，由于紫外线的消光系数通常比可见光高得多，紫外线QPM以高度对比的定量消光系数图的形式增加了新的信息层，作为传统定量相位图的补充测量。

这种方法的关键是含有蛋白质、脂质或核酸的生物材料的吸收随波长变化。当绘制波长与吸收的关系图时，这些材料显示出一个独特的 "曲棍球 "形状：吸收随着波长的减少而增加，在紫外线波段开始的地方有一个急剧增加。这种额外的吸收使紫外线成为一个有用的工具，在细胞成像中产生更高的对比度，而不需要添加人工染料。

当试图在实践中实施该方法时，作者在开发该技术时面临着几个挑战。首先，标准显微镜镜头通常不透射紫外线，因为它们所使用的玻璃通常是不透紫外线的。其次，玻璃的折射率在短波长下表现出更强的色散，使得在紫外光下的色度校正具有挑战性。

为了克服这些挑战，作者使用了一种特殊的基于镜面的显微镜物镜，特别是有限共轭的高数值孔径卡塞格伦型物镜，以避免色差并改善紫外光下的传输。他们还采用了最近开发的反射定量微分相位对比（qDPC）算法来检索复杂的折射率分布。该算法需要一组斜照强度图像来检索虚相信息，作者通过包括一个具有可旋转的半圆形振幅掩膜的紫外线透射性熔融石英透镜中继实现了这一点。

该掩膜阻挡了一半的瞳孔，并屏蔽了物镜的副镜的轴上照明，防止杂散光遮挡了来自样品的感兴趣的光。此外，其他的设计选择有助于保持视场中的光线均匀，同时减少成像区域外的样品的光线暴露，例如，将大直径抗日晒多模光纤的输出面与图像平面共轭。

作者还选择了一个具有窄（10纳米）带宽的紫外线LED，以尽量减少色度效应，并确保检索算法有一个明确的工作波长。由此产生的显微镜理论上应能达到212纳米的分辨率，而在实践中，作者几乎实现了这一点，在qDPC处理后的标准细胞系图像中测得的分辨率为~215纳米。

利用他们的新紫外显微镜，作者研究了肝脏窦状内皮细胞（LSECs），这是肝脏中薄薄的液体过滤细胞，其中含有被称为裂隙的小孔。由于其尺寸小（50-300纳米），使用传统的光学显微镜来观察这些孔隙具有挑战性。

值得注意的是，LSECs参与了人体的血液过滤系统，了解它们的结构和功能对疾病研究和药物发现至关重要。

用这种新的紫外显微镜来观察和研究LSECs的亚衍射极限大小的裂缝的能力是一个令人兴奋的发展，可以使人们更好地了解这些细胞在人体中的作用。作者将他们的紫外显微镜与其他显微镜技术进行了比较，包括明视野、微分干涉对比（DIC）显微镜和一个商业性的全息摄影系统，并发现紫外显微镜提供了卓越的对比度，并且是唯一允许他们观察接近衍射极限的单个裂缝的技术。

这凸显了无标签方法在对不明显散射的薄型和纳米级生物标本成像时面临的挑战。通过依靠吸收，紫外线显微镜克服了这一问题，并能利用这一波长体系中的显著消光系数，从薄而纳米级的生物样本中获得对比度更好的定量图像。

使用他们的紫外显微镜，作者能够分割单个潜在的孔隙集群并确定它们各自的消光系数。他们发现，平均而言，栅栏的消光系数高于浆膜的平均消光系数，并假设栅栏周围的细胞骨架蛋白的密度导致更高的吸收，尽管栅栏的 "孔 "中缺少生物材料。

作者还试图使用深紫外照明来产生自发荧光，但他们只在LSECs的栅栏群中检测到非常少量的信号，而且只是来自核区的漫反射光，这对于高分辨率的图像来说是不够的。总的来说，作者展示了他们的紫外线显微镜在研究LSECs和观察亚分光限大小的栅栏方面的能力，这对了解肝脏的过滤系统和相关疾病可能有重要意义。

总之，在高分辨率明视场显微镜中使用紫外线光吸收，比传统的染色方法具有显著的优势。这种技术为定量相位图提供了一种补充性的测量方法，为研究和科学发现提供了一种更准确、更有效的方式，而无需进行标记，从而保留了细胞的自然结构。

这篇论文发表在《光》杂志上。科学与应用。

More information: Florian Ströhl et al, Label-free superior contrast with c-band ultra-violet extinction microscopy, Light: Science & Applications (2023). DOI: 10.1038/s41377-023-01105-6